用于豬瘟病毒診斷的高敏配對單抗上市

• 研究背景

豬瘟病毒是ssRNA病毒，黃病毒科瘟病毒屬，其RNA為單股正鏈。病毒粒子呈圓形，大小為38～44nm，核衣殼是立體對稱二十面體，氯化銫中浮密度1.15～1.17g/ml，有包膜。豬瘟病毒在細胞質(zhì)內(nèi)復制,不能凝集紅血球，與牛腹瀉病毒有相關抗原。該病毒對**敏感，對溫度、紫外線、化學消毒劑等抵抗力較強。

豬瘟病毒能在豬胚或乳豬脾、腎、骨髓、淋巴結、白血球、結締組織或者肺組織的細胞中培養(yǎng)，但在這些細胞上不產(chǎn)生明顯病變?？衫秒u新城疫病毒強化試驗（END試驗)測定豬瘟病毒，作為診斷豬瘟的一種方法。

臨床診斷方法有：1.動物接種試驗易感豬接種是檢測豬瘟病毒的敏感方法。采取發(fā)病豬的血液或病死豬的淋巴結、脾臟、扁桃體等組織制成乳劑，無菌處理后接種易感豬（10-20Kg），觀察發(fā)病情況，然后再分離病毒。通常采用兔體交叉免疫試驗。2、檢測血清抗體檢測血清抗體可為豬瘟免疫提供依據(jù)，特別是酶聯(lián)免疫吸附試驗對檢測非典型豬瘟和溫和性豬瘟有重要作用。3、檢測豬瘟病毒直接免疫熒光抗體技術是檢測豬瘟病毒的一種快速診斷方法，該方法是采取豬的扁桃體或者豬腎、脾等組織做冰凍切片或觸片，經(jīng)丙酮固定，熒光抗體染色，在熒光顯微鏡下觀察，如果這些組織細胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)有亮綠色熒光，說明細胞內(nèi)存在豬瘟病毒，即可診為豬瘟。

   應市場需要，我們山東綠都生物食品安全檢測事業(yè)部歷時2年時間，開發(fā)了38株抗豬瘟鼠單抗，經(jīng)過配對測試，找出1組可以配對成功，并投入了市場進行臨床驗證。

二，目的意義

1，所開發(fā)試紙條產(chǎn)品用于檢測各廠家豬瘟活疫苗中有效抗原的含量，指導客戶與有關監(jiān)督部門考核產(chǎn)品。

2，所開發(fā)試紙條產(chǎn)品用于臨床病料的豬豬瘟病毒診斷，可用于扁桃體或者豬腎、脾等組織用于檢測豬瘟病毒。

• 鼠單抗質(zhì)量鑒定

①免疫熒光鑒定

1.ST細胞鋪96孔板一個，同時接毒，按照5%接毒，每孔接50ul。

2.48-120小時測定熒光。用0.01Mpbs洗三次后棄掉pbs，拍干。 3.加入冷乙醇（-20℃存放）固定20分鐘，放入-20℃后棄掉上清，不拍板。

4.pbs洗三次，棄上清，不用拍板，吸干水分。

5.加入一抗，按照0.1 mg/ml加入。37℃防置40分鐘，pbs洗三次，吸干水分。

6.加入二抗（按1:40加入，pbs稀釋）37 ℃防置40分鐘。Pbs洗4次，吸干水分，不拍板，觀察。

7.顯微鏡亮度：1.5亮度

注意：1.做不接毒的空白細胞對照。

         2.pbs洗要同一位點加入，要溫柔。

         3.鋪板同步接毒。

②膠體金初步鑒定

 18G4標記金，10A2 劃線組合，測定病毒液1:5稀釋，*。

所開發(fā)試紙條產(chǎn)品顯示： 1，所開發(fā)試紙條產(chǎn)品用于檢測各廠家豬瘟活疫苗中有效抗原的含量，可以將油佐劑疫苗冷凍破乳化，但不可以用乙醇和二甲基亞砜等使蛋白變性的有機溶劑破乳化。

2，所開發(fā)試紙條產(chǎn)品用于臨床病料的豬豬瘟病毒診斷，可用于扁桃體或者豬腎、脾等組織用于檢測豬瘟病毒。

配對情況：10A2-18G4    ，推薦10A2劃線，18G4標記金。

推薦使用濃度： 膠體金： 5微克/ml金液，劃線0.5-1mg/ml

                ELISA： 1：50 000-50 0000

                WB及免疫組化，免疫熒光：1:50-1：500

③ 特異性、符合率、穩(wěn)定性、靈敏度、假陽性率、假陰性率

特異性： 本配對抗體開發(fā)的試紙條產(chǎn)品只識別豬瘟病毒,與其他病毒無交叉反應。

符合率：本試紙條與PCR符合率99%。

穩(wěn)定性:  本試紙條常溫的保質(zhì)期為36個月。

靈敏度： 不低于PCR的靈敏度。

假陽性率： <5%

假陰性率:   0%

四、配套羊抗鼠二抗與萬能C線反應蛋白； CSFV純化標準陽性 抗原。

五、產(chǎn)品說明書附錄

生產(chǎn)公司：山東綠都生物科技有限公司

地址：山東省濱州市黃河二路169 綠都生物高科技園